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大豆ABC(ATP-Binding Cassette)转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究(2)

时间:2018-09-11 08:29来源:毕业论文
本研究拟在大豆中鉴定几个与脂质转运相关的ABC转运蛋白家族基因,以期为提高植物抗逆性和种子含油量奠定基础。此外,这方面的进一步研究将会对人类


本研究拟在大豆中鉴定几个与脂质转运相关的ABC转运蛋白家族基因,以期为提高植物抗逆性和种子含油量奠定基础。此外,这方面的进一步研究将会对人类ABC转运蛋白的研究提供重要线索,并起到很大促进作用[2]。
目前已有证据表明酵母位于过氧化物酶体中的PXA1基因(基因座为YPL147w),PXA2基因[3](基因座为YKL188c),位于质膜上的PDR5基因[4](基因座为YOR153w),PDR11基因[5](基因座为YIL013c)以及AUS1基因[6](基因座为YOR011w)参与油脂形成与运输。
拟南芥中的ABC transporter基因对于酵母突变体恢复脂质代谢功能的重要作用:如克隆拟南芥中具有影响脂质分泌及代谢的ABC transporters家族中的一类基因CrMRP2,并转运入缺乏ScYCF1基因(影响酵母脂质代谢)的酵母突变体dty168Δ时,酵母突变体恢复了脂质代谢的活性[7]。
AtABCA9 transporter对于拟南芥的脂质合成及代谢的作用:在拟南芥的内质网上定位到了ABC transporter的家族基因AtABCA9,同时缺乏AtABCA9的拟南芥突变体种子的油脂含量下降达35%,该基因提供丰富的脂肪酸用于脂质代谢。[8]
种种证据表明研究ABC转运蛋白在脂质转运方面的功能是有实际意义并且完全可行的。
1  材料与方法
1.1 材料
本项目中所用的的酵母野生型为BY4741(MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体,BY4742(MATα his3-Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)及其ybt1Δ突变体。野生型BY4742的突变体ybt1Δ由文献(Kailash Gulshan and W. Scott Moye-Rowley.Vacuolar Import of Phosphatidylcholine Requires the ATP-Binding Cassette Transporter Ybt1.2011.Trafic.12:1257-1268.)通讯作者Scott Moye-Rowley实验室提供。BY4741野生型及突变体ybt1Δ和BY4742野生型由本院梁永恒教授实验室提供。
    本项目中所用的拟南芥野生型为哥伦比亚0型,由本实验室自身提供。
1.2 方法
1.2.1 目的基因克隆
(1) 目的基因的选择
    从Phytozome的数据库中通过blastp算法获得酵母Aus1、Ybt1、Pdr18三种ABC转运蛋白氨基酸序列在大豆中的同源蛋白序列各三个,同时获取其cds序列,并设计引物。
(2) 大豆总RNA提取
a.将大豆幼苗叶片剪碎后用研磨棒研磨,期间不断加入液氮,直至裂解液呈无明显碎片的粉末状;转入离心管后,加入1 mLTotal RNA提取试剂Trizol溶液室温静置5 min;
b.将静置5 min后的裂解液12000 g, 4℃离心5 min,小心吸取上清液,转移入新的离心管中;
c.向上清裂解液加入氯仿(为加入Trizol溶液的1/5体积量),盖紧离心管盖,振荡,待充分乳化溶液呈乳状(无分相现象)后,室温静置5 min;
d.12000 g, 4℃离心15 min;
e.吸取上清液转移至另一新的离心管中,向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,室温静置10 min;
f.12000 g, 4℃离心10 min,弃上清,RNA沉于管底;
g.缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1 mL(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12000 g, 4℃离心5 min后小心弃去乙醇;
h.将离心管至于超净工作台中室温干燥5 min左右,加入适量的RNase-free水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后,经过电泳和紫外分光光度计(A260/A280)检测样品的RNA浓度和质量,于-80℃保存。
(3) 反转录cDNA的合成
按照PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)说明书进行操作:
a.在Mictotube 中配制下列反应混合液:
试剂
Contents    用量
Dosage of contents/μl
Oligo dT Primer ( 50μM )
dNtp Mixture ( 10 mM each ) 大豆ABC(ATP-Binding Cassette)转运蛋白基因在脂质分泌中的功能研究(2):http://www.lwfree.com/shengwu/lunwen_22856.html
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