摘要SAGA (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase)复合物是含有多个亚基的转录共激活因子，为响应环境压力，它能激活约 10％的酵母基因，是理解真核生物基因激活的范例。SAGA 有 4 个功能模块，可以执行多种功能。其中，HAT 模块（histone acetyltransferasemodule）主要发挥组蛋白乙酰转移酶的功能，这对组蛋白与其他蛋白之间的相互作用十分重要。HAT 模块主要由 GCN5、sgf29、Ada2、Ada3 四个亚基组成，而 GCN5 就是其中具有重要作用的组蛋白乙酰转移酶，它是SAGA 复合物第一表征为组蛋白乙酰化酶的原因所在；sgf29 亚基包含一个串联 Tudor 结构域，该结构域能识别含有组蛋白3 第 4 位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）的肽，这是体内组蛋白持续乙酰化所必须的。本文阐述了：HAT模块中 GCN5与 sgf29 亚基对应的 DNA 片段的 PCR 过程；两个亚基表达载体的构建；这些表达载体在大肠杆菌中的表达情况；以及表达的蛋白用亲和层析、分子筛层析的纯化结果。41304
毕业论文关键词 SAGA 复合物 GCN5/sgf29 亚基 基因表达 蛋白纯化
Title The Structural and Functional Analysis of GCN5 and sgf29subunits in HAT module
Abstract The SAGA (Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase) complex is a multi-subunittranscriptional coactivator that activates around 10% of yeast genes in responseto environmental stresses, and has served as a paradigm for understandingeukaryotic gene activation. SAGA has four functional modules and performsmultiple functions.Wherein, HAT module (histone acetyltransferase module) playsa major function of histone acetyltransferase ,which is very important for theinteraction between histones and other proteins.HAT module is mainly composed offour subunits including GCN5,sgf29,Ada2,Ada3.GCN5 is the histoneacetyltransferase which is of great importance,it explains the reason SAGA firstcharacterized as a histone acetyltransferase.Sgf29 contains a tandem Tudor domainthat recognizes H3K4me3-containing peptides and is required for histonehyperacetylation in vivo.This thesis covers:PCR of the DNA corresponding to GCN5and sgf29 subunits; the construction of different recombinant plasmids of thesetwo subunits;different outcomes of the two proteins expressed in E.coli;the resultof each protein when it is purified through affinity chromatography and sizeexclusion.
Keywords SAGA complex GCN5/sgf29 Subunits gene expression ProteinPurification
目次
1引言1
2实验材料、试剂与实验方法3
2.1主要实验器材3
2.2实验材料4
2.2.1目的DNA4
2.2.2载体4
2.2.3菌株5
2.2.4培养基5
2.2.5酶、化学试剂（盒）及其它材料6
2.3实验方法7
2.3.1大肠杆菌感受态细胞T1与Rosetta的制备7
2.3.2质粒载体转化进入感受态细胞T18
2.3.3质粒的抽提8
2.3.4DNA的酶切9
2.3.5DNA的纯化10
2.3.6载体与目的片段的连接10
2.3.7PAGE与SDS-PAGE的制作与相关跑胶操作10
2.3.8PCR实验13
2.3.9蛋白的表达提纯15
3实验结果与分析18
3.1载体质粒的扩增结果18
3.2PCR结果与分析18
3.2.1GCN5(1-454)的PCR结果与分析18
3.2.2sgf29(1-245)的PCR结果与分析19
3.3质粒载体与目的片段连接的结果分析20
3.3.1GCN5(1-454)对应DNA与载体的连接情况20
3.3.2sgf29(1-245)对应DNA与载体的连接情况22
3.4蛋白的表达与纯化22
3.4.1GCN5（1-454）的表达与纯化情况22
3.4.2sgf29（1-245）的表达与纯化情况23
3.5GCN5(1-454)与sgf29(1-245)的三文结构图24
3.5.1GCN5(1-454)的三文结构图24
3.5.2sgf29(1-245)的三文结构图24
结论25
致谢26
参考文献27
真核转录共激活因子是多亚基复合物，具有修饰染色质和识别组蛋白修饰的功能。真核细胞依赖于一个复杂的转录共激活因子复合物序列，用以调节诱导性基因的表达。这些转录共激活因子是典型的大型多蛋白复合物，其中包含能修饰染色质的酶结构亚基，以及能识别特定组蛋白修饰和帮助招募转录起始前的复合物。SAGA (Spt-Ada-Gcn5 乙酰转移酶）复合物是 1.8x106道尔顿的转录共激活因子，它在裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、小鼠(Mus musculus)、果蝇(Drosophila melanogaster)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)以及人(Homo sapiens)等真核生物细胞中都是保守的,它负责激活体内约 10%的基因转录[1, 2]。在裂殖酵母细胞中,SAGA 复合物大约由21 个蛋白质组成[3]。它含有 19 个亚基，可分为 4 个功能模块：乙酰化模块(Gcn5、Ada2、ADA3、Ngg1、Sgf29),负责组蛋白的乙酰化；去泛素化模块(Ubp8、Sgf73、Sgf11、Sus1),负责组蛋白的去泛素化；SPT模块(Spt3、Spt7、Spt8、Spt20、Hfi1、Tra1)与 TAF 模块(Taf5、Taf6、Taf9、Taf10、Taf12),这两个模块的亚基是 TATABOX的相关蛋白,负责染色质的重塑及招募其他转录因子到启动子区域,参与基因的转录调控[4,5]。酵母SAGA 复合物通过 Tra1 与特定转录激活物的相互作用被招募到基因位点[6]，而 Gcn5 的溴域则结合乙酰化 H3 和 H4 的 N-末端尾巴，这使得复合物与核小体合作共同乙酰化组蛋白H3 成为可能[7,8]。由 Gcn5，Ada2 和 Ada3 组成的 HAT 模块催化这种乙酰化，为结合额外的转录因子和起始前复合物（PIC）开辟了染色质层次的环境[9]。由于 HAT模块 （histone acetyltransferase module） 中 GCN5 的存在， 所以第一次发现 SAGA复合物时，它被认为是组蛋白乙酰化酶，其实它还有去泛素化酶等催化酶亚基。GCN5 亚基由 454 个氨基酸组成，它不仅包含一个组蛋白乙酰转移酶域和一个类似 Gcn5 的溴域，而且还具有一个扩展的 N-末端域，在体外它可以赋予在单核小体上的 H3 以及游离的 H3 上乙酰化的能力[10,11]。当 GCN5 的基因表达谱尚未在哺乳动物细胞中有报道时，酿酒酵母和裂殖酵母的酵母实验支持了一个想法，即 GCN5 是特定基因共激活因子，因为 Gcn5 分别调节两种酵母基因的 4％和 1.1％[12,13]。 HAT模块中GCN5与sgf29亚基的结构分析与功能研究:http://www.lwfree.com/shengwu/lunwen_41316.html